Le carcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie dévastatrice avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 11 %. Sa létalité est due à un diagnostic tardif et à une progression rapide vers les métastases. Diverses études génomiques à grande échelle ont identifié plusieurs mutations potentiellement responsables du PDAC, avec les gènes KRAS (K), TP53 (T), CDKN2A (C) et SMAD4 (S) montrant les fréquences de mutation les plus élevées. Notamment, les mutations du gène KRAS sont présentes dans plus de 90 % des tumeurs du PDAC. Dans notre projet de recherche, nous avons cherché à développer un modèle précancéreux qui reproduit le développement du PDAC en introduisant les quatre mutations clés dans des cellules épithéliales pancréatiques. Nous avons caractérisé ce modèle de manière exhaustive en cultures 2D et 3D et évalué son adéquation pour les tests de médicaments. Pour générer le modèle cellulaire, nous avons utilisé la technologie de modification génétique CRISPR/Cas9 pour cibler les cellules épithéliales canalaires pancréatiques humaines immortalisées (H6c7) afin de neutraliser trois gènes suppresseurs de tumeurs (C-T-S). De plus, nous avons conçu des vecteurs plasmidiques codant pour KRAS pour une expression continue et conditionnelle (en utilisant des systèmes TetR) du KRAS mutant. Pour améliorer l'efficacité de l'intégration du KRAS mutant, nous avons employé la transposase PiggyBac. Simultanément, nous avons neutralisé le gène KRAS pour explorer les voies cellulaires influencées par la perte de KRAS et identifier des cibles potentielles complémentaires à KRAS. Suite à chaque modification génétique, une sélection clonale a été effectuée, et les mutations génétiques ont été confirmées par des essais biologiques. Pour les gènes suppresseurs de tumeurs C-T-S, nous avons réussi à générer des lignées cellulaires avec des mutations simples et triples. Notamment, les cellules avec mutation triple ont montré une expression accrue de KRAS, entraînant une augmentation de la prolifération, de l'apoptose et des dommages à l'ADN. Cependant, lorsque nous avons tenté une expression continue des mutants de KRAS en utilisant des vecteurs plasmidiques, nous avons observé une induction de la sénescence dans les cellules de type sauvage et les cellules mutantes triples, empêchant l'établissement de clones stables. Pour surmonter ce défi, nous avons utilisé des vecteurs PiggyBac (PB) pour une expression conditionnelle de KRAS, validés par des essais de transfection. Par la suite, des lignées cellulaires stables PB ont été établies et caractérisées. Nous avons en outre évalué l'utilité de ces lignées cellulaires pour le dépistage de médicaments, en particulier en nous concentrant sur les dégradateurs et les inhibiteurs de KRAS mutant. De plus, nous avons exploré le potentiel de ces lignées cellulaires pour étudier l'initiation de la carcinogenèse en cultures 2D et 3D. Dans nos expériences de neutralisation de KRAS, nous avons réussi à obtenir des clones sur des bases de type sauvage et de mutation triple C-T-S. Nous avons observé que la perte de KRAS affectait la morphologie et la prolifération cellulaires. En conclusion, bien que p53 et p16 (produit du gène CDKN2A) soient traditionnellement reconnus comme des facteurs clés responsables de la sénescence induite par l'oncogène KRAS, nos premières constatations avec les mutants triples C-T-S indiquent que la délétion de ces gènes seuls n'est pas suffisante pour initier la carcinogenèse ou pour contrer la sénescence induite par KRAS. Cela suggère donc l'implication d'autres facteurs encore non identifiés, essentiels pour la carcinogenèse induite par KRAS. Nos données impliquant des cellules surexprimant KRAS et des cellules avec KRAS neutralisé soutiennent cette notion, indiquant que KRAS influence de multiples voies cellulaires, y compris celles régissant la taille, la morphologie, la dynamique et la régulation du cycle cellulaire.​

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