ARN polimerase

ARN polimerase ADN-dirixida
Identificadores
Número EC	2.7.7.6
Número CAS	9014-24-8
Bases de datos
IntEnz	vista de IntEnz
BRENDA	entrada de BRENDA
ExPASy	vista de NiceZyme
KEGG	entrada de KEGG
MetaCyc	vía metabólica
PRIAM	perfil
Estruturas PDB	RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum
Gene Ontology	AmiGO / EGO
Procura
PMC	artigos
PubMed	artigos
NCBI Protein	procura

A ARN polimerase ou RNA polimerase (abreviada como ARNpol, RNApol, RNAP ou ARNP), tamén chamada ARN polimerase ADN-dependente (EC 2.7.7.6), é un tipo de encima que produce ARN. Nas células a ARN polimerase é necesaria para formar cadeas de ARN utilizando como molde os xenes do ADN, nun proceso chamado transcrición xenética. Os encimas ARN polimerases son esenciais para a vida e encóntranse en todos os organismos e en moitos virus. En termos químicos, a ARN polimerase é unha nucleotidil transferase que polimeriza ribonucleótidos no extremo 3' dun transcrito de ARN.

Historia

A ARN polimerase descubrírona independentemente Samuel B. Weiss, Audrey Stevens, e Jerard Hurwitz en 1960.^[1] Naquela época, déranlle o premio Nobel de Medicina compartido de 1959 a Severo Ochoa polo descubrimento do que se pensaba que era a ARN polimerase,^[2] pero en realidade resultou ser a polinucleótido fosforilase.

O premio Nobel de Química de 2006 recibiuno Roger D. Kornberg por elaborar imaxes moleculares detalladas da ARN polimerase durante varias fases do proceso de transcrición.^[3]

Control da transcrición

O control do proceso da transcrición dun xene afecta aos patróns de expresión xénica e permite á célula adaptarse ao cambio de ambientes, realizar funcións especializadas nun organismo, e manter os procesos metabólicos básicos necesarios para a supervivencia. Por tanto, non é sorprendente que a actividade da ARN polimerase sexa longa, complexa e moi regulada. Na bacteria Escherichia coli, foron identificados máis de 100 factores de transcrición que modifican a actividade da ARN polimerase.^[4]

A ARN polimerase pode iniciar a transcrición en secuencias específicas de ADN coñecidas como promotores. Despois produce unha cadea de ARN, que é complementaria do molde da cadea do ADN. O proceso de engadir nucleótidos á cadea do ARN coñécese como elongación. Nos eucariotas, a ARN polimerase pode fabricar cadeas de ata 2,4 millóns de nucleótidos (a lonxitude total do longo xene da distrofina). A ARN polimerase libera preferentemente o seu transcrito de ARN cando chega a secuencias de ADN específicas situadas ao final dos xenes chamadas terminadores.

Os produtos da ARN polimerase son:

ARN mensaxeiro (ARNm). Molde para a síntese de proteínas nos ribosomas.
ARN non codificante ou "xenes de ARN". Unha ampla clase de xenes que codifican ARN que non se traduce a proteínas. Os exemplos máis salientables de xenes de ARN son os ARN transferentes (ARNt) e o ARN ribosómico (ARNr), que están ambos implicados no proceso de tradución. Porén, desde finais da década de 1990 atopáronse máis xenes de ARN, polo que se cre que desempeñan unha función máis importatne da que se pensaba previamente.
- ARN transferente (ARNt). Transfire aminoácidos específicos ás cadeas polipeptídicas en crecemento no sitio da síntese proteica no ribosoma.
- ARN ribosómico (ARNr). Un compoñente dos ribosomas
- MicroARN. Regula a actividade de xenes.
- ARN catalítico (ribozima). Moléculas de ARN encimaticamente activas.

A ARN polimerase realiza a síntese de novo, grazas ás interaccións específicas co nucleótido de iniciación que manteñen á ARN polimerase firmemente na súa posición, facilitando o ataque químico ao seguinte nucleótido. Estas interaccións específicas explican por que a ARN polimerase prefire empezar a transcrición con ATP (seguido de GTP, UTP, e despois CTP). A diferenza da ADN polimerase, a ARN polimerase ten tamén unha actividade helicase, polo que non se necesita outro encima para desenrolar o ADN.

Acción da ARN polimerase

A unión da ARN polimerase ao xene en bacterias implica o recoñecemento por parte do factor sigma da rexión central (core) do promotor, que contén os elementos -35 e -10 do promotor e, nalgúns promotores, tamén o dominio C-terminal da subunidade α ten que recoñecer os elementos que están augas arriba (cara ao extremo 5' ou upstream) do promotor. Hai moitos factores sigma intercambiables, cada un dos cales recoñece un conxunto diferente de promotores. Por exemplo, en E. coli, o factor σ⁷⁰ exprésase en condicións normais e recoñece os promotores dos xenes que se requiren nas condicións normais ("xenes de mantemento"), e o σ³² recoñece os promotores dos xenes requiridos en condicións de altas temperaturas ("xenes de choque térmico").

Despois de unirse ao ADN, a ARN polimerase cambia de formar un complexo pechado a formar un complexo aberto. Este cambio implica a separación das dúas cadeas do ADN para formar unha sección non enroscada do ADN de aproximadamente 13 pb, chamada burbulla de transcrición. Os ribonucleótidos están apareados complementariamente coa cadea molde do ADN, segundo os apareamentos de bases de Watson e Crick. O superenrolamento desempeña un importante papel na actividade da polimerase debido ao desenrolamento e re-enrolamento do ADN. Como as rexións do ADN situadas diante da ARN polimerase están desenroladas, hai superenrolamentos positivos compensatorios. As rexións situadas detrás da ARN polimerase son re-enroladas e prodúcense superenrolamentos negativos.

Como se indicou antes, a ARN polimerase fai contacto coa rexión promotora. Porén, estes contactos estabilizantes inhiben a capacidade do encima de acceder ao ADN situado máis en dirección augas abaixo (cara ao extremo 3') e impide así a síntese do produto en toda a súa lonxitude. Unha vez que se estabiliza o complexo aberto, a ARN polimerase sintetiza un filamento de ARN para estabilizar un heterodúplex de ADN-ARN (~8-9 pb) no centro activo, o cal estabiliza o complexo de elongación. Para realizar a síntese de ARN, a ARN polimerase debe manter contacto co promotor mentres desenrola máis ADN augas abaixo para a síntese, "estrullando" máis ADN de augas abaixo no complexo de iniciación. Durante a transición de escape do promotor, a ARN polimerase considérase un "intermediato estresado". Termodinamicamente o estrés acumúlase na molécula polas actividades de desenrolamento e compactación do ADN. Unha vez que o heterodúplex ADN-ARN é longo dabondo, a ARN polimerase solta os seus contactos augas arriba e consegue finalmente a transición de escape do promotor na fase de elongación. Porén, o escape do promotor non é o único resultado. A ARN polimerase pode tamén aliviar o estrés soltando os seus contactos augas abaixo, detendo a transcrición. O complexo de transcrición parado ten dúas opcións: (1) liberar o transcrito nacente e empezar de novo no promotor ou (2) restablecer un novo 3'OH no transcrito nacente no sitio activo por medio da actividade catalítica da ARN polimerase e recomezar a estrrullar o ADN para conseguir escapar do promotor. Acuñouse o termo "iniciación abortiva" para explicar os ciclos improdutivos da ARN polimerase antes da transición de escape do promotor. O alcance da iniciación abortiva depende da presenza de factores de transcrición e da forza dos contactos co promotor.

Elongación

A elongación da transcrición implica máis adicións de ribonucleótidos e o cambio do complexo aberto ao complexo transcricional. A ARN polimerase non pode empezar a formar transcritos de lonxitude completa porque está fortemente unida ao promotor. Nesta fase a transcrición principalmente orixina curtos fragmentos de ARN de arredor de 9 pb nun proceso coñecido como transcrición abortiva. Unha vez que a ARN polimerase empeza a formar transcritos máis longos deixa libre o promotor. Neste momento, desfanse os contactos cos elementos -10 e -35, e o factor σ sae da ARN polimerase. Isto permite que o resto do complexo da ARN polimerase se mova cara a adiante, mentres que o factor σ mentén ao complexo da ARN polimerase no seu sitio.

O complexo transcricional de 17 pb ten un híbrido ADN-ARN de 8 pb, é dicir, hai 8 pares de bases que están implicadas na unión do transcrito de ARN á cadea molde de ADN. A medida que progresa a transcrición, engádense os ribonuleótidos ao extremo 3' do transcrito de ARN e o complexo da ARN polimerase móvese ao longo do ADN. Aínda que a ARN polimerase non parece ter a actividade 3'-exonuclease que caracteriza a actividade de corrección de probas da ADN polimerase, hai evidencias de que a ARN polimerase pode pararse nos pares de bases que se aparearon incorrectamente e corrixilos.

Os residuos aspartil (de ácido aspártico) da ARN polimerase únense aos ións Mg²⁺, os cales, á súa vez, coordinan os fosfatos dos ribonucleótidos. O primeiro Mg²⁺ únese ao fosfato α do nucleósido trifosfato (NTP) que vai ser engadido. Isto permite o ataque nucleofílico do 3'OH do transcrito de ARN, engadindo outro nucleótido á cadea. O segundo Mg²⁺ únese ao pirofosfato do nucleósido trifosfato. A ecuación da reacción global é:

(NMP)_n + NTP → (NMP)_n+1 + PP_i

Terminación

Nos procariotas, a terminación da transcrición do ARN pode ser independente do factor rho ou dependente de rho:

A terminación da transcrición independente de rho realízase sen a axuda da proteína factor rho. A transcrición dunha rexión palindrómica do ADN causa a formación dunha estrutura en "forquita" a partir do transcrito de ARN que fai un bucle e se une a si mesmo. Esta estrutura en forquita é xeralmente rica nos pares de bases G-C, o que a fai máis estable ca o propio híbrido ADN-ARN. Como resultado, o híbrido ADN-ARN de 8 pb do complexo de transcrición cambia a un híbrido de 4 pb. Estas últimas 4 pares de bases son pares A-U, que se unen máis feblemente, e todo o transcrito de ARN sae do ADN.

ARN polimerases bacterianas

Nas bacterias a mesma ARN polimerase cataliza a síntese do ARN mensaxeiro e do ARN non codificante (ARNnc).

A ARN polimerase é unha molécula grande. O núcleo (core) do encima ten cinco subunidades (de ~400 kDa), que son:^[5]

β': A subunidade β' é a máis grande. Contén parte do centro activo responsable da síntese do ARN e contén algúns dos determinantes para as interaccións non específicas de secuencia co ADN e o ARN nacente.
β: A subunidade β é a segunda en tamaño. A subunidade β contén o restro do centro activo responsable da síntese do ARN e contén o resto dos determinantes para as interaccións non específicas de secuencia do ADN e o ARN nacente.
α^I e α^II: A subunidade α é a terceira subunidade máis longa e está presente en dúas copias por molécula de ARN polimerase, α^I e α^II. Cada subunidade α contén dous dominios: αNTD (dominio N-terminal) e αCTD (dominio C-terminal). A αNTD contén determinantes para a ensamblaxe da ARN polimerase. A αCTD (dominio C-terminal) contén determinantes para a interacción co promotor do ADN, realizando as interaccións non específicas de secuencia na maiorìa dos promotores e interaccións específicas de secuencia nos promotores que conteñen elementos augas arriba, e ademais contén determinantes para as interaccións con factores regulatorios.
ω: A subunidade ω é a menor de todas. Facilita a ensamblaxe da ARN polimerase e estabiliza a ARN polimerase xa ensamblada.

Para unirse aos promotores o núcleo (core) da ARN polimerase asóciase co factor de iniciación da transcrición sigma (σ) para formar o holoencima ARN polimerase. O factor sigma reduce a afinidade da ARN polimerase polo ADN non específico e incrementa a especificidade para os promotores, permitindo que a transcrición se inicie nos lugares correctos. O holoencima completo ten, pois, 6 subunidades: β'βα^I e α^IIωσ (~450 kDa).

ARN polimerases eucarióticas

Os eucariotas teñen varios tipos de ARN polimerases nucleares, cada un responsable da síntese dun tipo diferente de ARN. Todos están relacionados en estrutura e mecanismo de acción entre si e tamén coa ARN polimerase bacteriana:

A ARN polimerase I sintetiza un pre-ARNr de 45S (nos lévedos de 35S), que madura formando os ARNr de 28S, 18S e 5,8S, que formarán a parte principal dos ribosomas.^[6]
A ARN polimerase II sintetiza os precursores do ARNm e a maior parte dos ARN nucleares pequenos e dos microARNs.^[7] Este é o tipo de ARN polimerase máis estudado, e debido ao alto nivel de control requirido na transcrición cómpre a intervención dun conxunto de factores de transcrición para a súa unión aos promotores.
A ARN polimerase III sintetiza os ARNts, o ARNr 5S e outros ARNs pequenos que se encontran no núcleo da célula e no citosol.^[8]
A ARN polimerase IV sintetiza os ARN interferentes pequenos (siRNA) nas plantas.^[9]
A ARN polimerase V sintetiza os ARNs implicados na formación de heterocromatina dirixida por siRNA en plantas.^[10]

Os cloroplastos eucarióticos conteñen unha ARN polimerase moi similar estruturalmente e en mecanismo de acción á ARN polimerase bacteriana, chamada "polimerase codificada nos plastidios". Nos cloroplastos tamén se encontra un segundo encima ARN polimerase, non relacionado estruturalmente nin en mecanismo co bacteriano, chamado "polimerase codificada no núcleo", que é membro da familia proteica da "ARNP dunha soa subunidade".

A mitocondria eucariótica contén unha ARN polimerase non relacionada estruturalmente nin en mecanismo coa bacteriana, membro da familia proteica da "RNAP dunha soa subunidade".

Dado que as ADN polimerases e as ARN polimerases levan a cabo ambas unha polimerización de nucleótidos dependente do molde, podería agardarse que estes dous tipos de encimas estivesen estruturalmente relacionados. Porén, os estudos de cristalografía de raios X indican que, malia conteren ambas as dúas un ión Mg²⁺ crítico no sitio catalítico, son encimas virtualmente non emparentados, polo que os encimas polimerizadores de nucleótidos dependentes de patrón parece que evolucionaron independentemente dúas veces durante a evolución temperá das células. Unha liña evolutiva orixinou as modernas ADN polimerases e as [[reversotranscriptase]s, xunto cunhas poucas ARN polimerases dunha soa subunidade víricas. A outrra liña evolutiva deu lugar ás ARN polimerases celulares modernas.

ARN polimerases de arqueas

As arqueas teñen un só tipo de ARN polimerase, responsable da síntese de todos os ARN. As ARN polimerases arqueanas son estruturalmente e en mecanismo de funcionamento similares ás bacterianas e ás ARN polimerases I-V nucleares euc]arióticas, e están especialmente relacionadas coa ARN polimerase II nuclear eucariótica.^[11]^[12] O descubrimento da ARN polimerase das arqueas é bastante recente. As primeiras análises deste encima realizáronse en 1971, cando se purificou a ARN polimerase da arquea halófila extrema Halobacterium cutirubrum.^[13] As estruturas cristalinas obtidas das ARN polimerases de Sulfolobus solfataricus e Sulfolobus shibatae sitúan o número total de subunidades arqueanas identificadas en trece.^[11]^[14]

ARN polimerases víricas

Os ortopoxvirus sintetizan o ARN utilizando unha ARN polimerase codificada polo propio virus que está realacionada coas ARN polimerases bacteriana, arqueana, e coas ARN polimerases I-V nucleares eucarióticas. Na maioría do resto dos virus que sintetizan ARN utilizando unha ARN polimerase codificada no seu propio xenoma, esta non está relacionada coa bacteriana nin coa arqueana nin coas eucarióticas I-V nucleares. Moitos virus utilizan unha ARN polimerase ADN dependente dunha soa subunidade que está relacionada estruturalmente e en mecanismo coa ARN polimerase dunha soa unidade dos cloroplastos e mitocondrias eucarióticos e, en menor medida, coas ADN polimerases e as reversotranscriptases. Probablemente a máis estudada é a do bacteriófago T7 (ARN polimerase T7). Outros virus utilizan unha ARN polimerase ARN dependente (unha RNAP que emprega o ARN como molde en vez de ADN). Aparecen en virus de ARN de fibra negativa e en virus con ARN bicatenario, os cales teñen ambos durante parte do seu ciclo de vida ARN bicatenario. Porén, algúns virus con ARN de cadea positiva, como o virus da polio, tamén conteñen unha ARN polimerase ARN dependente.^[15]

Purificación da ARN polimerase

A ARN polimerase pode illarse das seguintes maneiras:

Utilizando unha columna de fosfocelulosa.^[16]
Por centrifugación en gradiente de glicerol.^[17]
Utilizando unha columna de ADN.
Por cromatografía de intercambio iónico.^[18]

E tamén combinando varias das técnicas anteriores.

Notas

↑ Jerard Hurwitz (2005). "The Discovery of RNA Polymerase". Journal of Biological Chemistry 280 (52): 42477–85. PMID 16230341. doi:10.1074/jbc.X500006200.
↑ Nobel Prize 1959
↑ Nobel Prize in Chemistry 2006
↑ Akira Ishihama (2000). "Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase" 54: 499–518. PMID 11018136. doi:10.1146/annurev.micro.54.1.499.
↑ Ebright RH (2000). "RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II". J Mol Biol 304 (5): 687–98. PMID 11124018. doi:10.1006/jmbi.2000.4309.
↑ Grummt I. (1999). "Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I.". Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 62: 109–54. PMID 9932453. doi:10.1016/S0079-6603(08)60506-1.
↑ Lee Y; Kim M; Han J; Yeom KH; Lee S; Baek SH; Kim VN. (2004). "MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II". EMBO J. 23 (20): 4051–60. PMC 524334. PMID 15372072. doi:10.1038/sj.emboj.7600385.
↑ Willis IM. (1993). "RNA polymerase III. Genes, factors and transcriptional specificity". Eur J Biochem. 212 (1): 1–11. PMID 8444147. doi:10.1111/j.1432-1033.1993.tb17626.x.
↑ Herr AJ, Jensen MB, Dalmay T, Baulcombe DC (2005). "RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA". Science 308 (5718): 118–20. PMID 15692015. doi:10.1126/science.1106910.
↑ Wierzbicki AT, Ream TS, Haag JR, Pikaard CS (2009). "RNA Polymerase V transcription guides ARGONAUTE4 to chromatin". Nat. Genet. 41 (5): 630–4. PMC 2674513. PMID 19377477. doi:10.1038/ng.365.
↑ ^11,0 ^11,1 Korkhin, Y., U. Unligil, O. Littlefield, P. Nelson, D. Stuart, P. Sigler, S. Bell and N. Abrescia (2009). "Evolution of Complex RNA Polymerases: The Complete Archaeal RNA Polymerase Structure." PLoS biology 7(5): e102.
↑ Werner, F. (2007). "Structure and function of archaeal RNA polymerases." Molecular microbiology 65(6): 1395-1404.
↑ Louis, B. G. and P. S. Fitt (1971). "Nucleic acid enzymology of extremely halophilic bacteria. Halobacterium cutirubrum deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase." The Biochemical journal 121(4): 621-627.
↑ Hirata, A., B. Klein and K. Murakami (2008). "The X-ray crystal structure of RNA polymerase from Archaea." Nature 451(7180): 851-854.
↑ Paul Ahlquist (2002) RNA-Dependent RNA Polymerases, Viruses, and RNA Silencing. Science 296 1270-1273
↑ Kelly JL; Lehman IR. (1986). "Yeast mitochondrial RNA polymerase. Purification and properties of the catalytic subunit". J Biol Chem. 261 (22): 10340–7. PMID 3525543.
↑ Honda A; et al. (1990). "Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8". J Biochem (Tokyo) 107 (4): 624–8. PMID 2358436.
↑ Hager; et al. (1990). "Use of Mono Q High-Resolution Ion-Exchange Chromatography To Obtain Highly Pure and Active Escherichia coli RNA Polymerase". Biochemistry 29 (34): 7890–7894. PMID 2261443. doi:10.1021/bi00486a016.

Véxase tamén

Outros artigos

Ligazóns externas

DNAi - DNA Interactive, con información e imaxes Flash da ARN polimerase.
MeshName - RNA+Polymerase [1]
Número EC 2.7.7.6
RNA Polymerase - Síntese do ARN a partir dun molde de ADN
estruturas en 3D da ARN polimerase do EM Data Bank(EMDB)

[1] Jerard Hurwitz (2005). "The Discovery of RNA Polymerase". Journal of Biological Chemistry 280 (52): 42477–85. PMID 16230341. doi:10.1074/jbc.X500006200.

[2] Nobel Prize 1959

[3] Nobel Prize in Chemistry 2006

[4] Akira Ishihama (2000). "Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase" 54: 499–518. PMID 11018136. doi:10.1146/annurev.micro.54.1.499.

[5] Ebright RH (2000). "RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II". J Mol Biol 304 (5): 687–98. PMID 11124018. doi:10.1006/jmbi.2000.4309.

[6] Grummt I. (1999). "Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I.". Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 62: 109–54. PMID 9932453. doi:10.1016/S0079-6603(08)60506-1.

[7] Lee Y; Kim M; Han J; Yeom KH; Lee S; Baek SH; Kim VN. (2004). "MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II". EMBO J. 23 (20): 4051–60. PMC 524334. PMID 15372072. doi:10.1038/sj.emboj.7600385.

[8] Willis IM. (1993). "RNA polymerase III. Genes, factors and transcriptional specificity". Eur J Biochem. 212 (1): 1–11. PMID 8444147. doi:10.1111/j.1432-1033.1993.tb17626.x.

[9] Herr AJ, Jensen MB, Dalmay T, Baulcombe DC (2005). "RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA". Science 308 (5718): 118–20. PMID 15692015. doi:10.1126/science.1106910.

[10] Wierzbicki AT, Ream TS, Haag JR, Pikaard CS (2009). "RNA Polymerase V transcription guides ARGONAUTE4 to chromatin". Nat. Genet. 41 (5): 630–4. PMC 2674513. PMID 19377477. doi:10.1038/ng.365.

[Korkhin,_Y._2009-11] 11,0 ^11,1 Korkhin, Y., U. Unligil, O. Littlefield, P. Nelson, D. Stuart, P. Sigler, S. Bell and N. Abrescia (2009). "Evolution of Complex RNA Polymerases: The Complete Archaeal RNA Polymerase Structure." PLoS biology 7(5): e102.

[12] Werner, F. (2007). "Structure and function of archaeal RNA polymerases." Molecular microbiology 65(6): 1395-1404.

[13] Louis, B. G. and P. S. Fitt (1971). "Nucleic acid enzymology of extremely halophilic bacteria. Halobacterium cutirubrum deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase." The Biochemical journal 121(4): 621-627.

[14] Hirata, A., B. Klein and K. Murakami (2008). "The X-ray crystal structure of RNA polymerase from Archaea." Nature 451(7180): 851-854.

[15] Paul Ahlquist (2002) RNA-Dependent RNA Polymerases, Viruses, and RNA Silencing. Science 296 1270-1273

[16] Kelly JL; Lehman IR. (1986). "Yeast mitochondrial RNA polymerase. Purification and properties of the catalytic subunit". J Biol Chem. 261 (22): 10340–7. PMID 3525543.

[17] Honda A; et al. (1990). "Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8". J Biochem (Tokyo) 107 (4): 624–8. PMID 2358436.

[18] Hager; et al. (1990). "Use of Mono Q High-Resolution Ion-Exchange Chromatography To Obtain Highly Pure and Active Escherichia coli RNA Polymerase". Biochemistry 29 (34): 7890–7894. PMID 2261443. doi:10.1021/bi00486a016.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]