Fragmento de Klenow
O fragmento de Klenow é un gran fragmento proteico con actividade encimática da ADN polimerase I da bacteria E. coli. Orixínase cando esta ADN polimerase I é clivada pola protease subtilisina, que elimina unha porción, e o que queda é o fragmento de Klenow. Obtívose en 1970 por H. Klenow et al.[1] Con respecto ao encima completo, o fragmento de Klenow mantén a actividade de polimerase 5' → 3' e a de exonuclease 3’ → 5’ para eliminar nucleótidos precodificados e a corrección de probas, pero perdeu a actividade de exonuclease 5' → 3' que ademais tiña o encima completo.
O outro pequeno fragmento orixinado na clivaxe desta polimerase mantén a actividade de exonuclease 5' → 3', pero non ten as outras dúas actividades que presenta o fragmento de Klenow.
Investigación
[editar | editar a fonte]Como a actividade exonuclease 5' → 3' da ADN polimerase I de E. coli fai que este encima sexa pouco axeitado para moitas aplicacións, o fragmento de Klenow, que non ten esa actividade, ten moitas aplicacións en investigación. O fragmento de Klenow é moi útil en tarefas de investigación que impliquen o seguinte:
- Síntese de ADN bicatenario a partir de moldes monocatenarios.
- Completar un extremo 3' que quedou máis curto dun fragmento de ADN para facer que o extremo 5' que sobresae quede igualado.
- Dixerir os extremos 3' que sobresaen.
- Preparar sondas de ADN radioactivas.
O fragmento de Klenow foi tamén o encima utilizado inicialmente para a amplificación de segmentos de ADN na reacción en cadea da polimerase (PCR),[2] pero despois foi substituído nesta técnica por encimas termoestables como a Taq polimerase,[3] que daban mellor resultado.
O fragmento de Klenow exo−
[editar | editar a fonte]Igual que para certas tarefas a actividade exonuclease 5' → 3' da ADN polimerase I de E. coli era un inconveniente, para certas aplicacións tampouco é desexable a actividade de exonuclease 3' → 5' que mantén o fragmento de Klenow. Este problema pode solucionarse introducindo mutacións no xene que o codifica. Como resultado, exprésanse formas do encima que presentan a actividade de polimerase 5' → 3', pero que carecen de actividade de exonuclease, xa que o sitio activo correspondente se ve afectado. Esta forma do encima denomínase fragmento de Klenow exo- ou fragmento de Klenow exo menos.[4]
O fragmento de Klenow exo- utilízase nalgunhas reaccións de marcaxe fluorescente para micromatrices, entre outras.
Notas
[editar | editar a fonte]- ↑ Klenow H and Henningsen I (1970). "Selective Elimination of the Exonuclease Activity of the Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited Proteolysis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65 (1): 168–175. PMC 286206. PMID 4905667. doi:10.1073/pnas.65.1.168.
- ↑ Saiki RK; et al. (1985). "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia". Science 230: 1350–54. PMID 2999980. doi:10.1126/science.2999980.
- ↑ Saiki; et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science 239: 487–91. PMID 2448875. doi:10.1126/science.2448875.
- ↑ "Thermo Scientific". Arquivado dende o orixinal o 04 de abril de 2014. Consultado o 25 de agosto de 2013.
Véxase tamén
[editar | editar a fonte]Ligazóns externas
[editar | editar a fonte]- MeshName - Klenow+Fragment [1]
- Diagrama en vivo.colostate.edu
